Transport plasmatique – Hormone Totale - Hormone libre

La T4 circule dans le sang sous deux formes en équilibre : l'une libre et l'autre liée à des protéines de transport. Chez un sujet euthyroïdien, seulement 0,02% de la T4 est libre, le reste est lié: 75-80% à la thyroxine-binding globulin (TBG), 15-20% à la préalbumine ou transthyrétine (TTR) et 5-10% à l’albumine. Il est généralement admis que seule l’hormone libre traverse la membrane capillaire et que le transport des hormones aux cellules cibles est proportionnel à la concentration d’hormone libre.

En raison de ses meilleures sensibilité et spécificité diagnostiques, le dosage de la fraction libre de T4 a supplanté celui de T4 totale (libre + liée) [Nelson, 1996]. Le dosage de T4 totale conserve un intérêt dans des situations particulières (anomalies des protéines de transport, T4 libre très élevée) et comme outil de recherche. La T4 totale peut être dosée dans le sérum à l'aide d'immunodosages compétitifs utilisant des marqueurs isotopiques, enzymatiques ou luminescents et des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. L’acide 8-anilinonaphtalène sulfonique (ANS) ou les salicylates sont utilisés pour dissocier les hormones thyroïdiennes des protéines de liaison. Une préparation candidate comme matériel de référence est disponible et plusieurs procédures de mesure candidates comme procédure de référence ont été décrites par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse avec dilution isotopique (ID/LC/MS). La comparaison des résultats des immunodosages à ceux de ces méthodes de référence fait apparaître la nécessité d’une recalibration des immunodosages.

Dosage de T4 libre (1,2)

Problématique

Ces dosages sont particuliers dans la mesure où le mesurande n’est qu’une très faible fraction de la T4 présente dans le sérum. A l’heure actuelle un groupe de travail de l’IFCC (Working Group for Standardization of Thyroid Function Tests, WG-STFT) a défini le mesurande comme la thyroxine qui n’est pas liée aux protéines dans le sérum ou le plasma à pH=7,4 et 37°C. Ce groupe est aussi chargé de proposer une méthode de référence permettant d’établir la traçabilité métrologique des dosages de la T4L dans le sérum. Les dosages en routine sont pratiqués à l’aide d’immunodosages dont les calibrateurs sériques devraient à l’avenir être étalonnés par rapport à la méthode de référence.

Quelle que soit la méthode, l’équilibre préexistant dans le sérum entre la fraction libre et la fraction de l’hormone liée ne doit pas être sensiblement perturbé. Pour ce faire, la quantité d’hormone extraite (libérée des protéines de transport) doit être la plus faible possible (2-3% au maximum) de façon à ce que l’équilibre qui s’établit dans le dosage soit le plus proche possible de celui préexistant dans le sérum circulant.

Méthode de référence (3)

Préalablement au dosage, la fraction d’hormone libre doit être séparée physiquement de la fraction liée. Le groupe de travail WG-STFT a décidé de proposer la dialyse dans des conditions précises de pH (7,4) et de température (37°C) comme technique de référence « conventionnelle » pour séparer la T4L (Fig. 1). La mesure de la T4L dans le dialysat doit ensuite être réalisée par une technique de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem avec dilution isotopique (ID/LC/tandem MS) calibrée avec le matériel de référence composé de thyroxine purifiée récemment mis au point (CRM IR-MM-468) et adaptée à des concentrations de l’ordre du picomolaire.

L’implication dans cette démarche des principaux fabricants présents dans ce domaine devrait dans un avenir plus très éloigné contribuer à améliorer l’harmonisation des résultats de T4L. En effet, celle-ci s’est nettement dégradée ces dernières années. Les distributions des résultats des derniers sérums de contrôle de qualité de l’AFSSAPS( IA52, IA53, et A54) apparaissent nettement bimodales.

Immunodosages de routine

Les dosages de T4L et T3L pratiqués dans les laboratoires d’analyses médicales sont des immunodosages relatifs calibrés avec des étalons sériques. Ces immunodosages impliquent une réaction directe du sérum avec un anticorps monoclonal ou polyclonal anti-hormone. Dans ces méthodes dites par immunoextraction, l’anticorps extrait (ou séquestre) une certaine quantité d’hormone qui doit rester proportionnelle à la concentration d’hormone libre initialement présente. C’est une condition indispensable à la validité du dosage.

Ces immunodosages compétitifs (en défaut d’anticorps) impliquent également un ligand qui entre en compétition avec l'hormone pour la fixation sur les sites anticorps. Un marqueur radioactif (RIA), enzymatique (EIA) ou luminescent (LIA) est fixé sur le ligand ou l’anticorps. Les techniques non radioactives sont facilement automatisables.

A l'heure actuelle les dosages les plus utilisés sont des immunodosages non radioactifs automatisés en deux étapes, ou en une étape, avec anticorps marqué ou ligand marqué. Les principales caractéristiques des méthodes de dosages des hormones libres sont résumées dans le tableau I.

Dosages en deux étapes

Dans la première étape, une fraction de l’hormone est extraite par l’anticorps anti-hormone immobilisé sur une phase solide. Après le lavage qui élimine le sérum, dans la seconde étape, l’ajout du ligand marqué (hormone ou dérivé marqué) permet la mesure des sites anticorps restés libres (Fig. 2).

Cette méthode repose sur des bases physico-chimiques bien établies et présente l’avantage de ne pas mettre en contact direct le ligand avec le sérum. Elle est, de ce fait, en principe à l’abri des interférences dues à des anomalies des protéines de transport ou à des anticorps anti-hormones thyroïdiennes. Son développement actuel est lié à son automatisation.

Dosages en une étape

Une seule incubation met en contact le sérum, le ligand et l’anticorps. Pour assurer la validité de ces dosages, le ligand doit conserver sa réactivité vis à vis de l’anticorps sans interagir avec les protéines de transport. D’une façon générale ce ligand peut être considéré comme un analogue de l’hormone avec laquelle il doit conserver une certaine parenté structurale. Le marqueur est porté soit par le ligand, soit par l’anticorps.

Les premières techniques par ligand marqué (Fig. 3) utilisaient un traceur radioactif. En raison de leur sensibilité à l'albuminémie, elles ont été abandonnées. Les ligands utilisés actuellement sont principalement des ligands macromoléculaires dans lesquels l’hormone est liée à une enzyme (traceur conjugué) ou à une immunoglobuline marquée. Ces ligands de masse molaire élevée ont en général une réactivité négligeable avec les protéines de transport. Des ligands biotinylés ou d'autres dérivés de l’hormone sont aussi employés.

Dans le cas de la technique par anticorps marqué (Fig. 4) le ligand est fixé à une phase solide ce qui bloque ou limite très fortement sa réactivité avec les protéines de transport. Pour le dosage de T4L le ligand est soit de la T4 (dosage homologue), soit de la T3 (dosage hétérologue).

Performances techniques

La limite de détection est en général < 2 pmol/l. Les coefficients de variation (imprécision totale) sont <7%.

Le domaine de mesure s’étend le plus souvent jusqu’à 100 pmol/l. Si le résultat d’un immunodosage dépasse le dernier point de la gamme d’étalonnage, un résultat exact ne peut pas être obtenu par dilution. En effet, après une dilution dans un milieu sans protéines, l'équilibre initial entre l’hormone liée et l’hormone libre tend à se rétablir. La dilution, qui entraîne une baisse de la capacité de fixation des protéines du sérum, est par contre un moyen simple de tester la sensibilité d’une méthode de dosage à cette variation. Dans un sérum normal, d’après la loi d’action de masse, la baisse ne devrait pas dépasser quelques pour cent pour une dilution jusqu’à 1/100.

Influence de la capacité de liaison du sérum et des inhibiteurs de liaison (maladies non thyroïdiennes sévères, traitements à l’héparine)

La majorité des immunodosages présentent un biais négatif par rapport à la dialyse quand la capacité de fixation des protéines de transport est abaissée. A l’inverse, le biais positif qui apparaît quand la capacité de fixation est augmentée, comme pendant la grossesse, est beaucoup plus modeste (4). La capacité de fixation est abaissée quand la concentration des protéines vectrices est abaissée et/ou quand des inhibiteurs de liaison (ou compétiteurs comme les acides gras libres AGL ou des médicaments) entrent en compétition avec les hormones thyroïdiennes pour la liaison aux protéines de transport, principalement l’albumine. Ceci s’observe en particulier chez des patients hospitalisés avec des pathologies sévères.

L’élévation de la T4L observée lors d'un traitement à l’héparine, même de bas poids moléculaire et à faible dose, est expliquée par la libération d'AGL, in vivo et in vitro (5). La libération d'AGL, conséquence de l'activation de la lipoprotéine lipase de l’endothélium vasculaire, est plus importante quand la concentration des triglycérides est élevée. En pratique, afin de minimiser l’effet de l’héparine de bas poids moléculaire, le prélèvement devra être effectué au minimum 10 heures après l’injection et le sérum conservé moins de 24h à 4°C avant dosage.

Étape préanalytique

La T4L est en général dosée dans le sérum. Le résultat n'est pas influencé par une hémolyse modérée. La nature de l’anticoagulant utilisé pour l’obtention d’un plasma doit être préalablement validée pour chaque méthode de dosage.

Le sérum est stable durant 8 jours à 4°C et doit être congelé à –20°C au delà. Cependant chez les patients traités à l'héparine le sérum ne sera pas conservé plus de 24 heures à 4°C (5).

Principales indications des dosages de T4 libre

Hyperthyroïdie

• Diagnostic : en présence d’une TSH abaissée, pour la distinction entre hyperthyroïdie infraclinique et franche, et pour la quantification d’une hyperthyroïdie franche.
• Traitement par anti-thyroïdiens de synthèse : à la phase d’acquisition de l’euthyroïdie, à partir de 4 semaines après l’instauration du traitement jusqu’à la récupération d’une valeur détectable de TSH.
• Traitement par iode radioactif : toutes les 4 à 6 semaines durant les 3 premiers mois jusqu’à la récupération d’une valeur détectable de TSH
• Traitement chirurgical : un mois après la thyroïdectomie puis jusqu’à la récupération d’une valeur détectable de TSH
• Surveillance des hyperthyroïdies liées à l’amiodarone.

Hypothyroïdie

• Diagnostic : en présence d’une TSH augmentée, pour la distinction entre l’hypothyroïdie fruste et franche, et pour la graduation de l’hypothyroïdie franche.
• Traitement d’une hypothyroïdie primaire : en cas de doute sur la compliance du patient.
• Traitement de l’hypothyroïdie secondaire ou tertiaire.
• Chez les sujets âgés et soumis au traitement par L-T4.

Références

1. Midgley JE. Direct and indirect free thyroxine assay methods: theory and practice. Clin Chem 2001;47:1353-63.
2. Sapin R, Schlienger JL. Dosages de thyroxine (T4) et triiodothyronine (T3) : techniques et place dans le bilan thyroïdien fonctionnel. Ann Biol Clin (Paris) 2003;61: 411-20.
3. Thienpont LM, Beastall G, Christofides NC, Faix JD, Ieri T, Jarrigue V, et al. Proposal of a candidate international reference measurement procedure for free thyroxine in serum. Clin Chem Lab Med 2007;45:934-6.
4. Sapin R, d’Herbomez M. Free thyroxine measured by equilibrium dialysis and nine immunoassays in sera with various serum thyroxine-binding capacities. Clin Chem 2003;49:1531-5.
5. Stevenson HP, Archbold GP, Johnston P, Young IS, Sheridan B. Misleading serum free thyroxine results during low molecular weight heparin treatment. Clin Chem 1998;44:1002-7.